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            分子細胞科學卓越創新中心周斌組在Trends in Cell Biology發表雙同源重組系統的綜述論文

            文章來源:分子細胞科學卓越創新中心  |  發布時間:2021-11-23  |  【打印】 【關閉

              

              10月15日,中國科學院分子細胞科學卓越創新中心(生物化學與細胞生物學研究所)周斌研究員在國際學術期刊Trends in Cell Biology發表了題為“Harnessing orthogonal recombinases to decipher cell fate with enhanced precision”的綜述文章。該文章系統地回顧了正交雙同源重組酶系統遺傳學操作的發展歷程,深入討論了雙同源重組酶系統在各個器官與系統中的應用如何彌補了單同源重組酶系統的局限進而厘清了各領域內的爭議問題,并且展望了正交同源重組酶系統未來的發展方向和新的研究思路。

              Cre-loxP同源重組系統是在多種模式生物,尤其是小鼠中,廣泛應用的遺傳學操作系統。Cre重組酶能夠識別loxP DNA序列并進行DNA序列插入、刪除和反轉操作。Cre-loxP系統常用于基因的條件型敲除或者重組刪除STOP cassette來啟動轉基因,例如報告基因的表達。盡管其已經發展成為組織特異性與可誘導型的系統,Cre-loxP系統依然存在一些局限性并且導致了一些研究中實驗結果的誤讀。與此同時,多種特異位點重組酶系統,例如Flp-frt、Dre-rox等在噬菌體等生物中被發現。在神經生物學領域中,Susan Dymecki等最早聯用Cre和Flp兩種特異位點重組酶來精確示蹤,發現了中央神經系統中脈絡叢和頂板結構的發育來源。由此開始,雙同源重組系統被逐步應用到多個研究領域中。該綜述以c-Kit+心肌干細胞的為例,聚焦于單重組酶系統依賴于單個基因調控元件的低特異性問題。c-Kit陽性的干細胞曾經被報道為內源性成體心臟干細胞,能夠分化為包括心肌細胞在內的多種細胞,為心血管疾病的治療帶來了希望。然而,三個研究組分別使用基于c-Kit的譜系示蹤工具并沒能發現成年小鼠中c-Kit細胞的成心肌能力。為了厘清這一問題,周斌研究課題組利用Cre和Dre兩種重組酶激活的雙同源重組系統(DeaLT)來排除傳統譜系示蹤技術示蹤c-Kit成體干細胞時對于心肌細胞的異位標記,實現了心肌細胞和cKit+非心肌細胞同時不可逆標記,從而精確地得出c-Kit陽性成體哺乳動物非心肌細胞在生理或病理情況下均不能發生向心肌細胞轉變的結論。DeaLT后續同樣被用于探尋所有非心肌細胞向心肌細胞的轉變,成體肝細胞和膽管上皮細胞轉化的可塑性,新生beta細胞的來源等各種需要同時精準示蹤多種細胞類型的問題。

              隨著單細胞轉錄組學等技術發展,同一細胞類型內的異質性被越來越清晰地認知。雙同源重組系統的選擇性標記能力也使得研究者能夠使用兩個標記基因以不同的遺傳學構造靶向它們的交集、補集或同時實現多個亞群的標記。通過構造新的基于Cre和Dre雙同源重組酶的遺傳學策略,周斌研究課題組實現了對于Sca1+細胞中的Sca1與PDGFRa或PDGFRb兩群雙陽性細胞的譜系示蹤,確認了Sca1+ 細胞在動脈平滑肌修復中的作用,并且揭示了Sca1+細胞亞群中各異的平滑肌修復能力。類似方法也被用于脂肪細胞前體細胞和氣管肺泡干細胞等細胞群的命運分析,以及神經系統中神經異質性和神經環路的標記。PDGFRa與PDGFRb雙陽性與單陽性亞群只有使用雙同源重組系統才能夠進行同時地標記并平行分析,從而直接就三種細胞亞群對于新生脂肪細胞的貢獻進行比較。傳統方法也無法特異標記同時表達Club和AT2細胞標記基因CC10和SPC的氣管-肺泡干細胞(BASCs),而研究人員通過雙同源重組系統和Split-Cre系統分別獨立對BASCs進行譜系示蹤并就其對于肺損傷的修復貢獻進行了探究。Josh Huang等則通過聯用腦區域病毒注射、Cre與Flp雙同源重組系統和Tet-On系統等,實現了通過神經連接、腦區位置、基因表達譜、發育時期和來源等多種維度的亞群標記GABA能神經元,對于揭示其各異的功能具有重大意義。

              為了更好地研究目標細胞的生理功能與機制,特定細胞亞群的基因敲除或者細胞清除也可以通過雙同源重組系統實現,彌補了廣泛基因敲除或細胞清除不特異在研究細胞亞群功能中的缺陷。周斌研究課題組通過Plin1-dCreER策略實現了靶向無特異標記基因的白色脂肪細胞亞群(WAT)的Cre活性,從而實現在WAT中轉錄因子PPARγ的編碼基因的敲除。此外,Wt1-CrexER通過Dre重組膜定位雌激素受體(ER)序列而將誘導型CreER轉化為持續性的Cre,從而在心臟中特異性敲除內皮細胞中的VEGFR2,造成了心臟血管生成障礙。而另一研究通過Flp激活的Cre進行Rbpj敲除也抑制了動脈的分化,細致地探究了血管生成和分化過程中的分子調控機制。以上系統最終的效應重組酶都是Cre,因此可以兼容以往為Cre設計的多種細胞探針或者報告基因。在細胞層面上,雙同源重組系統在脊髓背側興奮性或抑制性神經元中啟動白喉毒素受體(DTR)表達來介導特定神經元的清除,直觀地展示了這兩種神經元在痛覺感受神經回路中的不同作用,完善了對于痛覺感受通路的了解。胰島beta細胞特異的DTR表達和細胞清除也使得少數非beta細胞群分泌多種激素的可塑性得到揭示。

              除了利用雙同源重組系統高效而精準地實現細胞亞群中的基因敲除與細胞清除,多種雙同源重組系統構造策略也已經實現對于短暫性細胞狀態的無縫隙捕捉。Lgals-rox-STOP-rox-Cre的STOP在平滑肌細胞中被Dre重組,從而在Lgals3表達時啟動Cre。即使這一基因在細胞轉移完成后不再表達,也能實現所有Lgals3+平滑肌細胞的標記。揭示了平滑肌細胞在動脈粥樣硬化損傷修復中短暫表達Lgals3并首先移動到損傷處的過程。類似地,Kit-CreER通過切割Vimentin-LSL-Dre和N-Cadherin-LSL-Dre的STOP cassette,使得Dre可以在luminal細胞發生EMT時表達,幫助揭示這些基因在乳腺癌細胞發生上皮-間質細胞轉移時的作用和分子機制。研究生理環境下的短暫的細胞狀態差異例如細胞周期的改變同樣是非常重要的,而在肝細胞、心肌細胞或神經元中細胞周期活動都比較稀少和復雜。用傳統的核酸類似物摻入或者免疫熒光染色檢測這些細胞的增殖都會有信噪比低、可追蹤時間不長等問題,并會受到增殖更旺盛的巨噬或內皮等細胞的干擾。而基于單分子的長期譜系示蹤則局限于某些細胞亞群,不同的研究人員曾經提出Axin2+中央靜脈周圍肝細胞、Sox9+門靜脈周圍肝細胞理論或分散的Terthigh肝細胞具有增殖優勢。但是,利用Ki67-CrexER,周斌研究課題組實現了所有細胞類型或者肝細胞特異的增殖信息長時程、不間斷的記錄。而基于Ki67-CrexER的ProTracer可以看到Zone 2的肝細胞熒光標記數量尤其高,指征這一區域的增殖優勢。

              該綜述總結了多種類型的位點特異性重組酶及其遺傳學操作特點,還總結了各種正交同源重組系統的設計思路。盡管雙同源重組系統擁有揭示豐富的細胞和分子層面信息的能力,但其轉基因小鼠構造復雜程度較高,并且受到位點特異型重組酶本身特性的掣肘,在實際應用中依然存在一些問題。該綜述總結了重組酶非特異活性及雙同源重組系統轉基因小鼠構造繁瑣等缺點,并提示了未來突破以上問題和提高正交同源重組酶在各種細胞類型或狀態的準確標記和遺傳學操作能力的研究方向。此外,本文也展望了未來正交同源重組系統用于細胞間接觸或是各種細胞程序性死亡后標記的研究方向。

              中國科學院分子細胞科學卓越創新中心周斌研究組博士研究生翁文棟和劉秀秀為本文的共同第一作者,周斌研究員為本文的通訊作者。該項工作得到了香港中文大學醫學院的Kathy O. Lui教授的大力支持,以及來自中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門的經費支持。

              文章鏈接:https://www.cell.com/trends/cell-biology/fulltext/S0962-8924(21)00186-0 

            利用雙同源重組酶實現長時程不間斷記錄細胞事件

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